Opdagelsen af SmacCas9
du kan ændre den fædrene 5\(^{\prime}\)-NGG-3\(^{\prime}\) PAM specificitet af SpyCas9, tidligt, og de seneste rapporter har ansat dirigeret evolution (fx, “VQR”, “EQR”, “VRER”, og “NRNH” varianter) eller rationelt design informeret af krystal struktur (fx, “QQR”, “NG”, og “NR” varianter)17,18,19,20,21,22. Disse rapporter fokuserede på de PAM-kontaktende argininrester R1333 og R1335, der afskaffer funktionen, når de udelukkende muteres., Mens disse undersøgelser identificerede kompenserende mutationer, der resulterede i ændret PAM-specificitet, opretholdt de Cas9-varianter, de producerede, en guaninpræference i mindst en position af PAM-sekvensen for rapporteret in vivo-redigering. Samtidige rapporter har brugt evolutionære oplysninger yderligere at slappe af i de kanoniske 5\(^{\prime}\)-NNGRRT-3\(^{\prime}\) PAM specificitet af Staphylococcus aureus Cas9 (SaCas9) eller til at finde andre 5\(^{\prime}\)-NNNNCC-3\(^{\prime}\) PAM specificitet til den kanoniske 5\(^{\prime}\)-NNNNGHTT-3\(^{\prime}\) PAM af Neisseria meningitidis Cas923,24., Nukleaserne fra begge disse nye rapporter foretrækker dog stadig GC-indhold i mindst en position af PAM-sekvensen. Vi havde til formål at løfte sådanne GC-indhold forudsætninger via en brugerdefineret bioinformatik-drevet arbejdsgang, der miner eksisterende PAM mangfoldighed i Streptococcus genus25. Ved hjælp af denne strategi, vi homed i på SmacCas9 som har potentiale til at bære ændres ikke-GC PAM specificitet ved at tilpasse 115 orthologs af SpyCas9 fra UniProt (begrænset til dem med mere end 70% af parvise BLOSSOM62 score)., Fra alignment, vi fandt SmacCas9 var en af to tæt homologer, sammen med en Streptococcus mutans B112SM-EN Cas9 (SmutCas9), der er i besiddelse glutamines på begge positioner, der er afstemt efter den ellers meget bevaret PAM-kontakter argininer (Fig. 1a-b; supplerende Fig. 2A). Argininrester er kendt for stærkt at foretrække guaniner i aminosyre-base interaktionslandskabet, som det fremgår af 5\(^{\prime}\)-NGG-3\(^{\prime}\) specificiteten af SpyCas9. Glutaminrester binder på den anden side fortrinsvis til adeniner gennem interaktion med hovedsporkanten26., Vi antog således, at SmacCas9 naturligt havde coevolved de nødvendige kompenserende mutationer for at få ny ADENINRIG PAM-anerkendelse. En lille prøvestørrelse på 13 afstandsstykker fra det tilsvarende genoms CRISPR-array forhindrede os i at trygt udlede SmacCas9 PAM i silico., Ikke desto mindre, muligheden for SmacCas9 kræver mindre GC-indhold i sin PAM blev støttet af sekvens ligheder til “QQR” variant, der har 5\(^{\prime}\)-NAAG-3\(^{\prime}\) specificity27, ud over de PÅ-rige formodede konsensus PAM for fag-med oprindelse afstandsstykker i CRISPR arrays, der er forbundet med meget homologe SmutCas9, som blev identificeret ved hjælp af vores tidligere beskrevet SPAMALOT pipeline og i overensstemmelse med de tidligere forudsigelser (Fig. 1c; supplerende Fig. 2B; supplerende Fig. 3) 25,28.
en Sekvens alignment af SpyCas9, sin QQR variant, og SmacCas9. Trinnet i den understregende røde linje markerer sammenføjningen af SpyCas9 og SmacCas9 for at konstruere en SpyMac hybrid. Sekvenslogoet (onlineeblogo online tool) umiddelbart under justeringen skildrer bevarelsen på 11 positioner omkring de PAM-kontaktende argininer fra SpyCas9., B domæneorganisationen af SpyCas9 sidestillet over en farvekodet struktur af RNA-styret, målbundet SpyCas9 (PDB ID 5F9R). De to DNA-strenge er sorte med undtagelse af et magenta-segment svarende til PAM. Et Blå-Grøn-Rød farvekort bruges til mærkning af Cas9 PI-domænet og guide spacer-sekvensen for at fremhæve strukturer, der giver sekvensspecificitet og forekomsten af intra-domænekontakter inden for PI43. c En sekvens logo genereret online (WebLogo), som blev indlæst med formodede PAM sekvenser fundet i Streptococcus fag og forbundet med tæt SmacCas9 homologer.,
Engineering og PAM karakterisering af SpyMac
Vi fortsatte med empirisk at bestemme, PAM præferencer flere Streptococcus orthologs at ændre en eller begge af de kritiske PAM-kontakter. Baseret på demonstreret eksempler på PAM-interaktion domæne (PID) og vejledning RNA (gRNA) med cross-kompatibilitet mellem Cas9 orthologs, der er nært beslægtede og aktive, har vi bygget nye varianter af rationelt at udveksle PI region katalytisk “døde” SpyCas9 (dSpyCas9 med den valgte orthologs (Supplerende Fig., 2A-B) 29,30. Samlet varianter, herunder dSpyMacCas9 (heri benævnt dSpyMac), var hver for sig cotransformed i E. coli celler, sammen med guide RNA fra S. pyogenes og en 8-mer PAM-biblioteket i uniform base repræsentation i PAM-SCANR genetiske kredsløb, der er etableret af Leenay et al.31. Kredsløbet opregulerer en grøn fluorescerende protein (GFP) reporter i forhold til PAM-bindende styrke. Derfor indsamlede vi de GFP-positive cellepopulationer ved Flo .cytometri (supplerende Fig., 4) og Sanger sekventerede dem rundt på PAM ‘ s siteebsted for at bestemme positionsmæssige basepræferencer i en tilsvarende variants PAM-anerkendelse. dSpyMac, mere end dSpyMutCas9, genererede en sporprofil, der var mest konsistent med guaninuafhængig PAM-anerkendelse, sammen med en dominerende specificitet for adenindinukleotider (fig. 2a; supplerende Fig. 2C).
en Kromatogrammer, der repræsenterer PAM-SCANR baseret berigelse af variant-erkendelse af PAM-sekvenser fra en 5\(^{\prime}\)-NNNNNNNN-3\(^{\prime}\) bibliotek. b SYBR-farvet agarose geler, der viser, at in vitro-fordøjelse af 10 nM 5\(^{\prime}\)-NAAN-3\(^{\prime}\) substrater efter 16 minutters inkubation med 100 nM renset ribonucleoprotein enzym forsamlinger. Pile skelner mellem banding af de spaltede produkter fra ubladet substrat (øverste bånd)., Matri plots plots opsummere spaltede fraktion beregninger, som blev udført i en brugerdefineret script til behandling af gel billeder. Prøver blev udført i uafhængige biologiske duplikater (n = 2). C tidsforløb målinger af mål DNA substrat spaltning for SmacCas9 og SpyMac. d DNA substrat spaltning plottet som en funktion af 0,25: 1, 1:1, og 4: 1 molære forhold af ribonucleoprotein at målrette for vildtype SpyCas9 og hybrid SpyMac. Kildedata leveres som en Kildedatafil.,
dernæst rensede vi nuklease-aktive en .ymer for at fortsætte med at undersøge DNA-målgenkendelsespotentialet og det unikke ved SpyMac. (Supplerende Fig. 5A) 27, 32. Vi individuelt inkuberes den ribonucleoprotein komplekse enzymer (sammensat af Cas9 + crRNA + tracrRNA) med dobbelt-strenget mål substrater af alle 5\(^{\prime}\)/3\(^{\prime}\)-nærliggende base kombinationer på en adenin dinucleotide PAM (5\(^{\prime}\)-NAAN-3\(^{\prime}\); Fig. 2b)., En kort 16-min fordøjelse er angivet både wild-type SmacCas9 og hybrid SpyMac kløvet, der støder op til 5\(^{\prime}\)-NAAN-3\(^{\prime}\) motiver mere bredt og jævnt end de tidligere rapporterede QQR variant. SpyMac udmærkede sig yderligere med hurtige DNA-skærehastigheder, der ligner den hurtige fordøjelseskinetik af SpyCas9 (fig. 2c-D) 33. Vi kørte reaktioner, der brugte varierende crRNA spacer længder og tracrRNA sekvens, da sidstnævnte adskiller sig lidt mellem S. macacae og S. pyogenes genomer (supplerende Fig. 5B-E)., Ingen af disse to parametre kompenseret for den langsommere spaltning sats af SmacCas9, men vi lagde mærke marginale forbedringer i aktiviteten af vildtype-form med sin indfødte tracrRNA, som comports med grænsefladen af guide-Cas9 interaktion, der for det meste uden for PI-domæne.
Genom-redigering med iSpyMac
en CRISPResso2 indel analyse følgende NGS forstærket genomiske regioner til at vurdere, om målgruppen redigering af iSpyMac i forhold til SpyMac og SpyCas9, på den angivne 5\(^{\prime}\)-NAA-3\(^{\prime}\) og 5\(^{\prime}\)-NGG-3\(^{\prime}\) PAM-sekvenser. Prøver blev udført i to uafhængige transfektionsreplikater (n = 2). B effektivitet heatmap af mismatch tolerance assay på genomiske mål., Kvantificerede indel-frekvenser, som vurderet af TIDEVANDSALGORITMEN41, udstilles for hver mærket enkelt eller dobbelt mismatch i sgRNA-sekvensen for den angivne Cas9-variant og indikerede PAM-sekvens. Prøver blev udført i to uafhængige transfektionsreplikater (n = 2). C CRISPResso2 genomisk basisredigeringsanalyse efter NGS af genomiske amplikoner for at vurdere konvertering af cytosinertil thyminer ved iSpyMac-BE3. Prøver blev udført i to uafhængige transfektionsreplikater (n = 2). Alle kildedata leveres som en Kildedatafil.,
Næste, har vi vurderet tolerance af iSpyMac til uoverensstemmelse mellem sekvenser, ved at ansætte sgRNAs husly til dobbelt eller enkelt misforhold til en fast protospacer i AAVS-genet, er i besiddelse af en 5\(^{\prime}\)-GAAG-3\(^{\prime}\) PAM-sekvens. iSpyMac demonstrerede redigeringsfunktioner på mål med enkelte uoverensstemmelser inden for PAM-Pro proximimale segment af sgRNA., For at afbøde denne formodede off-target-tilbøjelighed introducerede vi r691a-mutationen, som tidligere blev isoleret via bakteriel udvælgelse for SpyCas9 for at opretholde høj on-target-aktivitet og samtidig reducere off-target editing35. Vores high-fidelity-variant, HiFi-iSpyMac, udviste næsten ubetydelig aktivitet på uoverensstemmende sekvenser sammenlignet med det originale en .ym med minimalt tab af On-target-aktivitet (fig. 3b).,
endelig valgte vi et vindue med fire nukleotider i VEGFA locus i en sekvenskontekst, således at enhver anden CRISPR-endonuclease med rapporteret anvendelse til baseredigering ikke ville tillade deres baseredigering med et cytidindeaminase-smeltet en .ym36. Derfor er vi cotransfected HEK293T celler med en nickase form af iSpyMac, der stammer fra de tidligere rapporterede BE3 arkitektur for cytosin base redigering (iSpyMac-BE3) og sgRNA plasmid rettet mod en PAM neden for den valgte nucleotides5., Vi målte effektive baseredigeringsniveauer i høstede celler, som udviste over 20% cytosin til thyminkonvertering i disse positioner via NGS-analyse (fig. 3c).