Eksperimentel Verifikation af Modeller
Den første tilgang (3) identificeres de primære indledning steder i 14 proteiner, herunder kvæg pancreas RNase og En kaskelot myoglobin, og også andre mindre stabile indledning steder (11) i RNase A. Den primære indledningen site for RNase En blev identificeret i denne model som rester 106-118. Anvendelse af den anden fremgangsmåde (8) til RNase A (13) førte til seks steder (illustreret i Fig., 3 A), som var i overensstemmelse med dem, der blev identificeret (11) ved den første metode (3). Disse er de rester, 4-11 (region A), rester 25-34 (område B), rester 51-57 (område C), og antiparallel strukturer (ikke nødvendigvis plisserede ark), dannes ved foreningen af rester 53-67 med rester 69-79 (område D), rester 71-90 med rester 91-111 (område E), og rester 103-111 med rester 115-124 (region F). De efterfølgende trin langs foldevejen består af væksten eller sammensmeltningen af disse regioner. Region G dannes, når rester 36-48 foldes mod Heli B. B., Region G, men indeholder en længere række kontakter, end ikke helix B. Derfor, at G er anset for at være for på et senere tidspunkt end B. Region L er dannet ved sammenslutning af område A med B, G og C. Det strukturelle forløb er fulgt af region H, der dannes, når de regioner, C og D kommer i kontakt med region K, der indeholder kontakter mellem regioner, E og F, region J, i hvilke regioner, C-og D-form kontakter med regioner, E og F; og med regionen i, som indeholder kontaktpersoner for regionerne E og H med G. Endelig, region M dannes, når En region kommer i kontakt med E og F.,
Den forventede primære folde indledningen site af RNase En er i overensstemmelse med de observerede tur på rester 113 og 114 i det oprindelige molekyle, med meget høj grad af bevaring af upolære restprodukter i stedet 106-118 af 23 arter af pattedyr af dette protein (3), og med eksperimentelle oplysninger om mellemprodukter opdaget i den termiske udfoldelse af RNase En (14)., NMR dokumentation for lokal struktur i udfoldet RNase En under folde betingelser (15) og i fragmenter heraf (16), og immunkemiske undersøgelser af dannelsen af stabile antigene steder (på overfladen af det protein, der dækker begravet primære hydrofobe indledningen site, når reduceret RNase En er oxideret (ref. 17 og figur 8 i ref. 18), var også i overensstemmelse med dette billede. Andre eksperimentelle beviser til støtte for eksistensen af initieringssteder A-F findes i ref. 11.,
For apomyoglobin, den første tilgang (3) identificeres de primære folde indledningen site som rester 103-115, der omfatter den største del af G helix, med den rækkefølge, Tyr-Leu-Glu-Phe-Ile-Ser-Glu-Ala-Ile-Ile-Hans-Val-Leu., Anvendelse af anden tilgang (8), og konformationelle-energi-beregninger, der førte til forslag om, at samspillet mellem A, G, og H helices af apomyoglobin kan være vigtigt for at folde indledning (19), i overensstemmelse med eksperimentelle resultater, der er involveret i disse regioner i ligevægt mellemprodukter af apomyoglobin (20) og i de tidligste kinetisk skridt i folde vej (21). Nylige eksperimentelle undersøgelser af myoglobinmutanter (22, 23) giver overbevisende støtte til modeller, der inkorporerer hydrofob initiering og udbredelse af foldning.,
Apomyoglobin er blevet et paradigme for forskning i foldeveje (24). En del af apomyoglobin molekyle, bestående af A, G, og H helices og en del af B-helix, folder hurtigt at danne sig et på-vej mellemliggende, med den resterende del af polypeptid kæde folde i et langsommere tempo, i størrelsesordenen sekunder (21, 25). Peptidfragmenter af apomyoglobin svarende til G-og H-spiralerne viste en tilbøjelighed til spiralformet struktur (26-28), hvorimod peptider svarende til resten af proteinet viste langt lavere tilbøjelighed til Heli .dannelse (29)., Alligevel viste et eksperiment, hvor H-Heli .en af myoglobin blev muteret for at mindske dens spiralformede tilbøjelighed (30), meget lidt indflydelse på proteinets foldningshastighed. En meget større effekt blev observeret, når den distale histidin (H64) blev ændret til phenylalanin: substitutionen af en ikke-polær sidekæde til det begravede polære histidin resulterede i en signifikant stigning i foldningshastigheden (31). Disse undersøgelser pegede mod betydningen af side-kæde pakning, især i kontaktfladerne af spiraler, for hastigheden af foldning af apomyoglobin.,
Apomyoglobin har den fordel, at det kan studeres ved ligevægt under en række opløsningsbetingelser, der tilnærmer nogle af de observerbare stadier på den kinetiske foldevej. Det har således været muligt at definere de konformationelle tilbøjeligheder af udfoldet og delvist foldet apomyoglobin ved NMR (32-35). Interessant nok viser syre-udfoldet apomyoglobin en tilbøjelighed til ikke-nativ spiralformet struktur i et område, der forbinder D-og E-spiralerne, såvel som den native-lignende struktur observeret i A-og H-spiralerne, som var blevet forudsagt i de kinetiske undersøgelser (34)., NMR studier af konformationelle tilbøjeligheder af de forskellige former for apomyoglobin (32-35), som indgår bestemmelse af afslapning parametre polypeptid kæde til site-specifikt bestemme rygraden dynamik i hver af de stater, af protein. I stedet for den “model-gratis” – analyse, der er egnet til foldede proteiner, afslapning data blev analyseret ved at beregne reduceret spectral density funktioner, J(0), J(wN), og J(wH) (36). Funktionen J (0) informerer om µs–ms tidsskala bevægelser og foreslog, at for apomyoglobin ved pH 2.,3 gjorde A-og G-spiralerne forbigående kontakter (34). Dette spændende resultat, der senere blev valideret af spin-label NMR-undersøgelser (37), gav endelig bevis for native-lignende langdistancekontakter i et udfoldet protein. Endnu mere interessant viste funktionen J (nn), der informerer om PS–ns tidsskala bevægelse, sekvensafhængig variation, som kunne korreleres med variation i en beregnet parameter, “gennemsnitsarealet begravet ved foldning” (aabuf) (10)., Dette parameter, som indeholder både rester størrelse og hydrophobicity, der er defineret for de enkelte aminosyrer, men er normalt beregnet som et gennemsnit over et vindue af fem til ni rester i sekvens-og giver en alternativ kvantitative skøn over den hydrophobicity defineret af Matheson og Scheraga (3) i form af gratis energi af dannelsen. I tilfælde af apomyoglobin ved pH 2,3, toppe i plottet af J (nn) vs., restantal, der angiver begrænsning af sub-ns tidsskala-bevægelsen, svarede ekstremt godt med toppe i aabuf-plottet, hvilket indikerer et højere end gennemsnitligt antal store og/eller ikke-polære aminosyrer. Denne observation antydede, at der er et mønster i aminosyresekvensen, defineret ved grupperinger af store og/eller ikke-polære sidekæder, som i modellen til ref. 3, der fører til begrænsning af bevægelsen af polypeptidrygraden forårsaget af lokal hydrofob klyngedannelse.
Apomyoglobin ved pH 2.,3 bevarer en lille tilbøjelighed til spiralformet struktur i A-og H-spiralerne, som bedømt af de observerede NMR kemiske forskydninger (34). Disse tilbøjeligheder afskaffes i nærvær af 8 M urinstof (35), Men sekvensafhængigheden af afslapningshastighederne for urinstof-denatureret apomyoglobin viser også en spændende sammenhæng med aabuf-parameteren. I dette tilfælde er sammenhængen mellem minima i J(wH) og maksima af AABUF, hvilket tyder på, at lokale hydrofobe interaktioner, der begrænser rygraden motion på sub-ns tidsskalaer er vedholdende selv i 8 M urinstof.,
for at teste hypotesen om, at aabuf-parameteren, dvs.hydrofobicitet, kunne bruges til at forudsige de foldende initieringssteder i polypeptidkæden, blev der lavet et specifikt sæt apomyoglobinmutationer (23). Det er En spiral, der deltager i den kinetiske mellemprodukt, der er dannet først ved foldning af WT apomyoglobin, har en sekvens, der giver anledning til et maksimum i AABUF parameter, der henviser til, at E-helix, der er faktisk meget hydrofobe i henhold til den konventionelle hydrophobicity skalaer, har en forholdsvis lav AABUF i hele dens længde., I foldet apomyoglobin, sidekæde af Trp-14, i En helix, ligger overfor rygraden af E helix på Gly-73. Der blev fremstillet et dobbeltmutant myoglobin, hvor Trp-14 blev erstattet med Gly, og Gly-73 blev erstattet med Trp. Det blev begrundet, at den foldede struktur af proteinet skulle være minimalt forstyrret af denne s .ap, men at aabuf parameteren for A-og E-spiralerne skulle påvirkes drastisk. Spørgsmålet var, om foldevejen også ville blive påvirket. Faktisk forekommer foldning af mutanten, hvor G73 og .14 byttes, ved en anden vej end proteint-proteinet., Alle apomyoglobinvarianter, der hidtil er blevet undersøgt, foldes via et burstfase-mellemprodukt, der indeholder spiralformet struktur. I tilfælde af WT-apomyoglobin indeholder dette mellemprodukt A -, G-og H-Heli theerne (og også en del af B-Heli .en). I G73 -1414 s .ap-mutanten indeholder mellemproduktet E, g og H helices; a-Heli .en er ikke beskyttet i den indledende fase af foldning, men foldes senere. Dette resultat (illustreret i Fig. 4) blev bekræftet af spin-label-undersøgelser, der viste kontakter mellem E -, G-og H-spiralerne i mutanten snarere end A -, G-og H-kontakterne observeret i WT-proteinet.,