Tento materiál je doprovázen prezentace na bílkovinné struktury a principy denaturace vzorků a diskontinuální gelová elektroforéza.
oddělení makromolekul v elektrickém poli se nazývá elektroforéza. Velmi častou metodou pro separaci proteinů elektroforézou používá diskontinuální polyakrylamidovém gelu jako podpora střední a dodecyl sulfát sodný (SDS), aby došlo k denaturaci proteinů. Metoda se nazývá elektroforéza dodecylsulfátu sodného polyakrylamidového gelu (SDS-PAGE)., Nejčastěji používaný systém je také nazýván Laemmli metoda po BRITÁNII Laemmli, kdo první zveřejní papír zaměstnávání SDS-PAGE ve vědecké studie.
SDS (také nazývaný laurylsulfát) je aniontový detergent, což znamená, že po rozpuštění jeho molekuly mají čistý záporný náboj v širokém rozmezí pH. Polypeptidový řetězec váže množství SDS v poměru k jeho relativní molekulové hmotnosti. Záporné náboje na SDS ničí většinu složité struktury proteinů a jsou silně přitahovány k anodě (pozitivně nabitá elektroda) v elektrickém poli.,
Polyakrylamidové gely omezují migraci větších molekul tak rychle jako menší molekuly. Protože náboj-k-hmotnostní poměr je téměř stejná mezi SDS-denaturované polypeptidy, konečné separaci proteinů je závislá téměř výhradně na rozdíly v relativní molekulární hmotnost polypeptidů. V gelu s jednotnou hustotou je relativní migrační vzdálenost proteinu (Rf, f jako index) negativně úměrná protokolu jeho hmotnosti., Pokud jsou proteiny známé hmoty spuštěny současně s neznámými, může být vykreslen vztah mezi Rf a hmotou a odhadnuty hmotnosti neznámých proteinů.
separace Proteinů pomocí SDS-PAGE může být použita k odhadu relativní molekulové hmotnosti, k určení relativního množství hlavních proteinů ve vzorku a k určení distribuce proteinů mezi zlomky. Čistota vzorků bílkovin může být posouzena a může být dodržen postup frakcionace nebo čištění., Různé metody barvení mohou být použity k detekci vzácných proteinů a dozvědět se něco o jejich biochemických vlastnostech. Specializované techniky, jako je například Western blotting, dvourozměrné elektroforézy, a peptidové mapování lze použít k detekci velmi vzácných genových produktů, najít podobnosti mezi nimi, a rozpoznat a oddělit izoenzymy bílkovin.
molekulová hmotnost versus molekulová hmotnost
molekulová hmotnost (symbol m) je vyjádřena v Daltonech (Da). Jeden Dalton je definován jako 1/12 hmotnost uhlíku 12., Většina makromolekul je dostatečně velká, aby používala kiloDalton (kDa) k popisu molekulární hmotnosti. Molekulová hmotnost není stejná jako molekulová hmotnost. To je také známé jako relativní molekulová hmotnost (symbol Mr, kde r je index). Molekulová hmotnost je definována jako poměr hmotnosti makromolekuly k 1/12 hmotnosti atomu uhlíku 12. Je to bezrozměrné množství.
když literatura dává hmotnost v Da nebo kDa, odkazuje se na molekulární hmotnost. Je nesprávné vyjádřit molekulovou hmotnost (relativní molekulovou hmotnost) v Daltonech., V některé literatuře však najdete termín molekulární hmotnost používaný s Daltony nebo kilodaltony, často používající zkratku MW pro molekulovou hmotnost.
Polyakrylamidové gely pro SDS-PAGE
bylo vyvinuto mnoho systémů pro proteinovou elektroforézu a přístroje používané pro SDS-PAGE se velmi liší. Metodika použitá na těchto stránkách využívá metodu Laemmli. Odkaz na metodu Laemmli v sekci materiály a metody eliminuje potřebu popsat pufry, odlévání gelů, přístrojů atd., Pokud se papír využívá nějaké modifikace metody, pouze detaily SDS-PAGE, která by měla být uvedena v metodách části jsou procenta celkového množství akrylamidu (%T) v gelu, relativní procento a typ crosslinker (%C), a možná i odkaz na gel rozměry. Používáme systém „mini-gel“ s gelovými kazetami 3 1/4″ x 4″.
SDS-PAGE lze provádět na předem odlitých gelech, což šetří potíže a riziko práce s akrylamidem. Následující popis platí pro odlévací a běžící přístroje vyrobené v obchodě, které jsou mnohem levnější než komerčně dostupná zařízení., Kromě efektivity nákladů je výhodou výroby vlastních gelů poprvé hlubší pochopení procesu.
bez ohledu na systém vyžaduje příprava odlévání dvou různých vrstev akrylamidu mezi skleněné desky. Spodní Vrstva (oddělující nebo rozlišující gel) je zodpovědná za skutečné oddělení polypeptidů podle velikosti. Horní vrstva (stohovací gel) zahrnuje studní vzorku. Je navržen tak, aby zametal proteiny ve vzorku mezi dvěma pohyblivými hranicemi tak, aby byly stlačeny (naskládány) do mikrometrových tenkých vrstev, když dosáhnou oddělovacího gelu.,