Experimentální Ověření Modelů
první přístup (3) identifikována primární zahájení lokalit v 14 proteiny, včetně bovinní pankreatické RNase a myoglobin vorvaně, a také jiné, méně stabilní zahájení lokalit (11) v RNase A. primární iniciační stránky pro RNase A byl identifikován v tomto modelu jako zbytky 106-118. Použití druhého přístupu (8) K RNase A (13) vedlo k šesti místům (znázorněno na obr., 3 a), které byly v souladu s těmi, které byly identifikovány (11) prvním přístupem (3). Tyto jsou zbytky 4-11 (regionu), zbytky 25-34 let (region B), zbytky 51-57 (oblast C), a antiparalelních struktur (ne nutně skládaný listy) tvoří sdružení zbytky 53-67 s rezidua, 69-79 (region D), zbytky 71-90 se zbytky 91 až 111 (oblast E), a zbytky 103-111 se zbytky 115-124 (oblast F). Následující kroky podél skládací dráhy spočívají v růstu nebo koalescenci těchto oblastí. Oblast G vzniká, když zbytky 36-48 násobí proti šroubovice B., Oblast G, nicméně, obsahuje delší-rozsah kontaktů, než je tomu helix B. Proto G je považován formulář na později než v Regionu B. L je tvořen sdružení region s B, G, a C. Tento strukturální sekvenci následuje oblast H, kdy se tvořil oblastech C a D přijít do styku; podle regionu K obsahující kontakty mezi regiony, E a F; podle regionu J v jakých oblastech C a D formulář kontakty s regiony, E a F; a podle regionu jsem obsahující kontakty regionech E a H s G. Konečně, region M je tvořen, když regionu přichází do kontaktu s E a F.,
předpokládaná primární skládací zahájení místě RNase A je ve shodě s pozorovaným obrátit na zbytky 113 a 114 v nativní molekuly, s velmi vysokým stupněm ochrany nepolární rezidua v místě 106-118 z 23 druhů savců tohoto proteinu (3), a s experimentální informace pro meziprodukty detekován v tepelné rozvíjející RNase A (14)., NMR důkazy pro lokální struktury v rozloženém RNase A pod skládací podmínky (15) a v jejich fragmenty (16), a imunochemické studie na vytvoření stabilní antigenní místa (na povrchu proteinu, pokrývající pohřben primární hydrofobní zahájení stránky, když sníží RNase A je oxidován (ref. 17 a obrázek 8 z ref. 18), byly také v souladu s tímto obrázkem. Další experimentální důkazy podporující existenci iniciačních míst A-F jsou uvedeny v ref. 11.,
Pro apomyoglobin, první přístup (3) identifikována primární skládací zahájení stránky jako zbytky 103-115, který zahrnuje hlavní část G helix, s sekvenci Tyr-Leu-Glu-Phe-Ile-Ser-Glu-Ala-Ile-Ile-His-Val-Leu., Použití druhého přístupu (8), a konformační-energetické výpočty, vedl k návrhu, že interakce mezi A, G, a H šroubovice z apomyoglobin by mohlo být důležité pro skládání zahájení (19), v souladu s experimentálními výsledky, které se podílí tyto regiony v rovnováze meziprodukty apomyoglobin (20) a v nejbližší kinetické kroky při skládání dráhy (21). Nedávné experimentální studie mutantů myoglobinu (22, 23) poskytují přesvědčivou podporu modelům, které obsahují hydrofobní iniciaci a šíření skládání.,
Apomyoglobin se stal paradigmatem pro výzkum skládacích cest (24). Součástí apomyoglobin molekula, která se skládá z A, G, a H stabilizovaných a části B helix, záhyby rychle tvořit na cestu, střední, s zbývající část polypeptidového řetězce skládací pomalejším tempem, v řádu sekund (21, 25). Peptidové fragmenty apomyoglobin odpovídající G a H spirál ukázal sklon pro šroubovicovou strukturu (26-28), vzhledem k tomu, že peptidy odpovídající zbytku proteinu vykazovaly daleko nižší sklon šroubovice formace (29)., Zatím experiment, ve kterém H helix myoglobinu byl zmutovaný snížit své spirálové sklon (30) ukázala velmi malý vliv na skládání sazba bílkovin. Mnohem větší účinek byl pozorován při distální histidin (H64) byl změněn na fenylalanin: substituce nepolární postranní řetězec pro pohřben polární histidinu za následek výrazné zvýšení rychlosti skládání (31). Tyto studie poukázaly na důležitost balení postranního řetězce, zejména v kontaktních plochách šroubovic, pro rychlost skládání apomyoglobinu.,
Apomyoglobin má tu výhodu, že může být studován v rovnováze za řady podmínek řešení, které přibližují některé pozorovatelné fáze na kinetické skládací dráze. Bylo tedy možné definovat konformační sklony rozloženého a částečně složeného apomyoglobinu NMR (32-35). Je zajímavé, že kyselina-se rozvinula apomyoglobin ukazuje sklon k non-nativní helikální struktury v regionu, který spojuje D a E šroubovice, stejně jako nativní-jako struktury pozorované v a H šroubovice, což byl předpověděl v kinetické studie (34)., NMR studie konformační sklony různé formy apomyoglobin (32-35) součástí stanovení relaxace parametry polypeptidového řetězce na místě-konkrétně určit páteřní dynamika v každém ze států bílkovin. Namísto analýzy“ bez modelu“, která je vhodná pro složené proteiny, byla relaxační data analyzována výpočtem funkcí se sníženou spektrální hustotou J(0), J(wN) a J(wH) (36). Funkce J (0) informuje o pohybech v časovém měřítku µs–ms a navrhla, že pro apomyoglobin při pH 2.,3, spirály a A G vytvářely přechodné kontakty (34). Tento vzrušující výsledek, později ověřena spin-label NMR studie (37), za předpokladu, definitivní důkaz nativní-jako dálkové kontakty v rozloženém bílkovin. Ještě více zvláštní je, že funkce J(wN), která informuje na ps–ns času rozsahu pohybu, ukázala sekvence závislé na variantě, která by mohla být v korelaci s rozdíly v vypočítaný parametr „průměrná plocha pohřben na skládací“ (AABUF) (10)., Tento parametr, který zahrnuje jak reziduí velikosti a hydrofobicity, je definován pro jednotlivé aminokyseliny, ale je obvykle v průměru přes okno z pěti na devět zbytky v sekvenci a poskytuje alternativní kvantitativní odhad hydrofobicita definován Matheson a Scheraga (3) z hlediska volné energie tvorby. V případě apomyoglobinu při pH 2,3 vrcholy v grafu J (wN) vs., počet reziduí, které indikují omezení pohybu v časovém měřítku sub-ns, velmi dobře odpovídal špičkám v grafu AABUF, které naznačují vyšší než průměrný počet velkých a/nebo nepolárních aminokyselin. Toto pozorování naznačovalo, že v sekvenci aminokyselin existuje vzorec definovaný seskupeními velkých a/nebo nepolárních bočních řetězců, jako v modelu ref. 3, což vede k omezení pohybu polypeptidové páteře způsobené lokální hydrofobní tvorbou clusteru.
Apomyoglobin při pH 2.,3 zachovává malý sklon ke spirálové struktuře ve spirálách A A H, jak je posuzováno pozorovanými chemickými posuny NMR (34). Tyto sklony jsou zrušeny v přítomnosti 8 M močoviny (35), přesto sekvence závislost relaxace sazby močoviny denaturované apomyoglobin také ukazuje zajímavou souvislost s AABUF parametr. V tomto případě je korelace mezi minima v J(wH) a maxima z AABUF, což naznačuje, že místní hydrofobní interakce, které omezují páteř pohybu na sub-ns čas váhy jsou přetrvávající i v 8 M močoviny.,
testovat hypotézu, že AABUF parametr, tj., hydrofobicita, by mohly být použity k předpovídat skládací zahájení lokalit v polypeptidový řetězec, konkrétní sadu apomyoglobin mutace byly provedeny (23). Na šroubovice, která se podílí na kinetickou intermediate, že je nejprve vznikají při skládání WT apomyoglobin, má sekvence, která dává vzniknout maximálně v AABUF parametr, vzhledem k tomu, E šroubovice, která je ve skutečnosti vysoce hydrofobní podle konvenční hydrofobicita váhy, má poměrně nízké AABUF po celé jeho délce., Ve složeném apomyoglobinu leží boční řetězec Trp-14 ve spirále a naproti páteři spirály E v Gly-73. Byl připraven dvojitý mutantní myoglobin, ve kterém byl Trp-14 nahrazen Gly a Gly-73 byl nahrazen Trp. To bylo odůvodněné, že složené struktury bílkovin by měla být minimálně rozrušen tento swap, ale že AABUF parametr a a E šroubovice by měla být výrazně ovlivněny. Otázkou bylo, zda bude ovlivněna také skládací cesta. Skládání mutantu, ve kterém jsou vyměněny G73 a W14, se skutečně vyskytuje jinou cestou než protein WT., Všechny varianty apomyoglobinu, které byly dosud studovány, se skládají prostřednictvím meziproduktu fáze roztržení, který obsahuje spirálovou strukturu. V případě APOMYOGLOBINU WT obsahuje tento meziprodukt šroubovice a, G A H (a také část šroubovice B). V G73–W14 swap mutant, intermediate obsahuje E, G, a H šroubovice, šroubovice není chráněn v počáteční fázi skládání, ale záhyby později. Tento výsledek (znázorněno na obr. 4) byly potvrzeny spin-label studie ukazující kontakty mezi e, g a H spirály v mutantu, spíše než a, G A H kontakty pozorované v proteinu WT.,