Hranice Veterinární Vědy

Úvod

Bezobratlých patří přibližně jeden milion živočišných druhů chovaných jak v zoologických zařízeních a v domácnostech, kde jsou ruce zvednuté jako exotická zvířata (1). Plži tvoří téměř 60 000 druhů vodních i suchozemských měkkýšů, především hlemýžďů a slimáků (1). Obří africký šnek (Achatina fulica, syn., Lissachatina fulica) je nativní do Východní Afriky, je však rozšířené invazivní druhy v Asii, Oceánii, a více nedávno v Americe, kde byl představen náhodně nebo cíleně jako zdroj potravy a jako domácího mazlíčka. Jeho uvolňování v přírodních ekosystémech, zemědělských a městských oblastech vedlo k ekologickým, zdravotním a zemědělským hrozbám (2, 3). Obří Africké zemi šnek je meziprodukt hostitele pro několik parazitů včetně Aelurostrongylus abstrusus, Angiostrongylus cantonensis, Angiostrongylus costaricensis, Schistosoma mansoni, Hymenolepis spp.,, a Fasciola hepatica (4, 5). Všechny výše uvedené hlísty, s výjimkou a. abstrusus, jsou schopny způsobit závažné onemocnění u lidí. Konkrétně obří Africké zemi šnek je hlavní gastropod zodpovědný za celosvětové šíření A. cantonensis, že příčiny lidského eozinofilní meningoencefalitida v Asii a Americe (2, 6). Rizikové faktory pro infekce u člověka, domácí zvířata a volně žijících živočichů s těmi, parazitární parazity patří požití syrového nebo nedostatečně tepelně infikovaného hlemýždě nebo slimáky, nebo potraviny kontaminovány slizu z infikovaného hlemýždě nebo slimáky (4, 5, 7, 8).,

i když Afrických obřích hlemýžďů patří mezi nejoblíbenější šneci drženy jako domácí zvířata, a jejich celosvětovou popularitu jako exotická zvířata rychle roste, jen několik byly provedeny průzkumy na výskyt jejich parazitů v přírodních podmínkách (2, 6, 9-11). Cílem tohoto průzkumu bylo zjistit výskyt parazitů u obřích afrických suchozemských hlemýžďů chovaných jako domácí zvířata v jižní Itálii.,

Materiály a Metody

Obecné Údaje

V srpnu 2018, tři bazény čerstvé fekální vzorky získané z celkem 60 obřích Afrických hlemýžďů, stále ve třech různých soukromých sbírkách se nachází v Pozzuoli, Caserta, Neapol (Itálie), byly zkoumány pro parazity. Z každé lokality jsme získali kaluž výkalů od 20 jednotlivých hlemýžďů. Hlemýždi zahrnutí do tohoto průzkumu měli střední věk 1, 6 roku v rozmezí od 0, 2 do 2 let a neobdrželi žádnou předchozí antiparazitární léčbu., Hlemýždi byli krmeni čerstvou zeleninou a ovocem; navíc doplňování vápníkového prášku (Calcium, Exo Terra, Hagen Deutschland GmbH & Co. KG, Holm, Německo) byl poskytován dvakrát týdně. Všechna zvířata byla chována v Itálii, v soukromém vlastnictví a drženi jako mazlíčci ve čtyřech vnitřních teráriích o rozměrech 60 × 30 × 45 cm ve velikosti, ve skupinách 10-20 zvířat (2 skupiny po 20 šneci v Pozzuoli a Caserta a 2 skupiny po 10 šneci každý v Neapoli)., Organická rašelina půdy (Organické Coco-Rašeliny, E-Coco Produkty, Gloucestershire, velká BRITÁNIE), dříve tepelně opracovaných (100°C po dobu 30 min) a pak se bez parazitů a hmyzu, byl použit jako substrát.

diagnostické postupy

dvacet gramů čerstvých výkalů bylo zpočátku získáno z každého ze čtyř terárií., Když spojí výkaly analyzovány čerstvého nátěru, flotační a Baermann test ukázal pozitivitu až rhabditid hlístice, dva šneci z každého pozitivního terárium byli ubytováni jednotlivě ve sterilním plastovém boxu, a jejich výkaly byly shromážděny, ihned po defekaci, do sterilní 50 ml plastové zkumavky. Coprological vyšetření na sdružené a individuální vzorky zahrnuty čerstvého nátěru, radiální flotační (2 g stolice pro každý test) pomocí roztoku cukru a formaldehydu (specifická hmotnost 1.27) a Baermann test (10 g výkalů pro každý test)., Kromě toho byl hlen získaný během čerstvého vyšetření nátěru analyzován pod světelným mikroskopem. Protože larvální formy několika druhů hlístů může encyst uvnitř noha svalové hlemýžďů, histologické vyšetření biopsie vzorky sklizené z přední a zadní oblasti nohou svalové byla provedena v 30 hlemýžďů, v narkóze s technikou popsal Giannelli et al. (12) a Gilbertson a Wyatt (13)., Vzorky biopsie byly fixovány v 10% neutrálním formalinu pufrovaném fosfátem a rutinními metodami zpracovány na parafínové bloky, které byly rozřezány na 3 µm tlusté části a obarveny hematoxylinem a eosinem. Studie byla provedena na základě povolení praxe, kde se konala, a pod podepsaným, písemným informovaným souhlasem vlastníka.

Morfologická Identifikace

Dočasné držáky byly vyrobeny za tepla-zabít hlístic na sklíčko do kapky vody, po kterém skleněný kryt skluzu byla použita., Nematody byly přeneseny do kapky vody z vodovodu na skleněnou sklíčko a umístěny na ohřívač (100°C) po dobu 10 s. tyto vzorky byly použity pro morfologickou identifikaci. Pro pozorování byl použit amplivální světelný mikroskop Carl Zeiss Jena a Leitz Diaplan s nomarskou optikou., Morfologická identifikace rhabditid hlístice následoval Andrassy (14) a Andrassy (15) a bylo to hlavně na základě morfologie hltanu a stomie, a reprodukční systém, zejména vlastnosti fragmentů, počet a pozici papil nebo přítomnost a velikost nebo tvar bursa pro muže; a ocas tvar, postavení vulvy a morfologie reprodukčního systému u žen. Identifikace larv byla založena na tvaru ocasu.

Molekulární Analýzy

DNA byla extrahována z hlístice vzorky získané z pevné výkaly v 96% ethanolu, získané ze tří lokalit., Nematody se před molekulární analýzou promyly v dvojdestilované vodě (ddH2O) přes noc pro úplné odstranění zbytků ethanolu. Každá jednotlivá háďátka byla převedena do sterilní mikrozkumavky (200 µl) 20 µl extrakčního pufru (17.7 µl ddH2O, 2 µl 10 × koncentrovaný PCR pufr, 0.2 µl 1% Tween 20 a 0,1 µl proteinázy K). Pufr a nematody byly zmrazeny při -20 ° C po dobu 20 minut a poté se okamžitě inkubovaly při 65 ° C po dobu 1 hodiny, poté 10 min při 95°C., Lyzáty byly ochlazeny na ledu a poté odstředěny (2 min, 9 000 g); pro PCR bylo použito 1 µl supernatantu.

fragment obsahující rDNA vnitřní přepisována distanční oblasti (ITS1, 5,8 S, ITS2) byl amplifikován pomocí primerů 18: 5′-TTG ATT ACG TCC CTG CCC TTT-3′ (dopředu), a 28S: 5′-TTT CAC TCG CCG CTA TTA AGG-3′ (reverse) (16). Fragment rDNA obsahující gen pro 18s rRNA byl zesílen pomocí primerů 22F: 5 ‚- TCC AAG GAA GGC AGC AG GC-3 ‚(vpřed) a 1080jr: 5′- TCC TGG TGG TGC CCT TCC GTC AAT TTC-3‘ (vzad) (17). PCR master mix sestával z: ddH2O, 7.,25µl; 10 × PCR pufr, 1,25 µl; deoxynukleosidtrifosfáty (dNTPs), 1 µl; 0,75 µl forward I reverse primeru; polymeráza, 0,1 µl; a 1 µl dna-extraktu. PCR profily byly použity takto: na 1 cyklus 94°C po dobu 7 min následovaná 35 cykly 94°C po dobu 60 s, 50°C po dobu 60 s a 72°C po dobu 60 s, a závěrečná elongace při 72°C po dobu 7 min (14); pro 18S 1 cyklus 94°C po dobu 5 min, následovalo 35 cyklů 94°C po dobu 60 s, 55°C na 90 s a 72°C po dobu 2 min a závěrečná elongace při 72°C po dobu 10 min., Produkty PCR byly sekvenovány společností GATC Biotech (Německo) a později upraveny a nahrány do GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/).

Výsledky

Baermann test odhalil přítomnost hlístice, jejichž délka se pohybovala od 170 do 336 µm, ve všech vzorcích. Vejce, larvy a dospělé rhabditidové hlístice byly detekovány čerstvými metodami rozmazání a flotace ve všech fekálních vzorcích. Rhabditella axei (Obrázek 1) byla morfologicky identifikována ze dvou ze tří sdružených a jednotlivých fekálních vzorků z Pozzuoli a Neapole. Kromě toho, Rhabditis terricola, Cruznema sp.,, a Pristionchus entomophagus byly izolovány z jednoho bazénu a jednotlivých fekálních vzorků z Caserty. Ve vzorcích svalové biopsie nebo v hlenu nebyly zjištěny žádné parazity.

Několik morfologických typů rhabditid hlístice byly izolovány z šnečí výkaly pevné v 96% ethanolu. Získané a upravené sekvence ITS a 18 z těchto hlístic byly srovnávány (BLAST) s materiálem v GenBank a identifikoval se jako R. axel (částečné 18, přistoupení číslo MK124578, podobnost 99%), Rh., terricola (částečné 18S a částečné ITS1, přistoupení číslo MK156052, podobnost 100%), P. entomophagus (částečné 18S a částečné ITS1, přistoupení číslo MK156050, podobnost 99%) a Cruznema sp. (částečné 18S a částečné ITS1, přístupové číslo MK156051, podobnost 96-100%).

Diskuse

výsledky této studie naznačují, že všechny zkoumané obří Africké zemi šneci kladou vajíčka, larvy a dospělé rhabditid hlístic v trusu, a proto mohou představovat zdroj infekce pro ostatní zvířata a lidi. Aby se zabránilo nesprávné identifikaci se Strongyloides sp.,, hlístice druhů vykazuje podobnost s rhabditids, že má jasnou parazitární zoonotické pro ehp (14, 15, 18), počáteční morfologické diagnózy rhabditid hlístic byla potvrzena pomocí molekulární analýzy.

Rhabditidae zahrnují Volně žijící saprofytické nematody, široce nalezené v půdě a organických troskách, kde se živí hlavně bakteriemi. Mnoho druhů hlemýžďů může sloužit jako konečné definitivní hostitelé pro rhabditid nematodes (14, 15). Nicméně, řada druhů Rhabditis a Rhabditella byla spojena s obratlovci včetně lidí (14, 15, 19-27)., Ačkoli jejich přítomnost může být důsledkem kontaminace životního prostředí, mohou tyto nematody způsobit onemocnění u mnoha zvířat a lidí. Rhabditis elongata, Rh. hominis a Rh. larvy usuii byly izolovány z lidských výkalů, moči a vaginálních tamponů (19-21). U lidí však nebylo hlášeno mnoho případů symptomatických infekcí (21-24). Feng a Li (25) popsali dva lidské případy infekce močových cest R.axei v Číně a Ahn et al. (20) hlášeno pět lidských případů střevní infekce Rhabditis sp. ve venkovských školních dětí Jižní Koreje., Podobně, dva případy lidské střevní infekce. R. axel byly popsány v Číně (26), vzhledem k tomu, že další publikované práce (21) uvádí, v případě střevní infekce v 5-měsíc-staré Brazilské dítě, které bylo představeno s horečkou a vodnatá a krvavý průjem; coprological vyšetření odhalilo vejce, larvy a dospělé Rhabditis sp. Meamar et al. (27) popsal výskyt vodnatého průjmu u dvou íránských pacientů s AIDS, spojených s těžkou střevní infekcí larvami a dospělými vzorky R.axei. Konečně, Teschner et al., (24) nedávno popsal případ vnějšího zvukovodu infekce v 37 letý muž prezentovány s hnisavý otorrhea z obou uší a akutní ztráta sluchu způsobená Rhabditis sp. Obecně platí, že Rhabditis spp. jsou považovány za nejčastější příčinou vnější zánět středního ucha u skotu, žijící v tropických oblastech (např. v jižní Americe a Africe), zvláště u starších zvířat, a byly zjištěny také u kuřat, psů a prasat s incoercible průjem (18, 28-30). Byly však také popsány asymptomatické infekce a tyto nematody jsou často považovány za pseudoparazity (28, 29).,

přestože byly volně žijící hlístice získány ve všech vzorcích stolice, nebyly nalezeny žádné vzorky v hlenu a histologických vzorcích. Možným vysvětlením tohoto zjištění je, že nematody mohou lokalizovat v různých tkáních / orgánech svých hostitelů, v závislosti na typu asociačního hostitele nematoda/měkkýše (15, 31, 32). Rhabditis spp. dokončete svůj životní cyklus uvnitř hlemýžď, bez poškození hostitele měkkýšů. Předchozí studie o volně žijících afrických hlemýžďů (Archachatina spp. a Achatina spp.) odhalil, že R., axei žije v gastrointestinálním traktu svého hostitele hlemýžďů, kde je dokončen celý životní cyklus nematody (31-33).

i když Afrických obřích hlemýžďů jsou uvedeny jako hostitelé pro R. axel, výskyt této hlístice byly hlášeny pouze v několika druhů obřích Afrických hlemýžďů jiné než A. fulica, a to Archachatina marginata ovum, Ar. marginata saturalis a Achatina achatina (31). Na druhou stranu, P. entomophagus má celosvětovou distribuci a byl spojen především na dung brouci patřící do nadčeledi Scarabaeoidea (34, 35), R., terricola byla nalezena v salamandrech (14, 15) a Cruznema spp. v kriketu Gryllodes laplatae (Orthoptera) (36). Ve všech případech dochází k přenosu parazita kontaktem hlemýžďů s kontaminovanou vlhkou půdou, která je bohatá na rozkládající se organickou hmotu (31, 37). I když v projednávaném případě všechna zvířata byla chována v teráriích s tepelně ošetřené organické půdy, domníváme se, že infekce může mít došlo před nákupem zvířat v obchodech se zvířaty nebo chovná zařízení.,

Na závěr naše výsledky naznačují, že domácí obří Afričtí suchozemští hlemýždi mohou sloužit jako nádrž několika rhabditidových nematodů. Tento šnek druhy patří mezi nejčastěji ty chovaných jako domácí zvířata, a proto často žijí v těsné blízkosti lidí. V důsledku toho je možná kontaminace domácího prostředí jejich výkaly. Přestože parazitické hlístice nebyly izolovaných v této studii, obřích Afrických hlemýžďů by měl být stále považovány za potenciální přenašeči háďátka schopen způsobit oportunní onemocnění u člověka., Proto zdůrazňujeme, že je důležité dále epidemiologický výzkum o výskytu volně žijících a parazitických hlístic v plži plži chovaní v zajetí, a zdůrazňují, že je třeba pro přísné kontrolní opatření, aby se snížilo riziko oportunní infekce s rhabditid hlístice v pet hlemýžď vlastníků.

Autor Příspěvky

Dd ‚ O a MS koncipován a plánované analýzy. MS a JN provedly analýzu. CA pomohl utvářet výzkum a upravil rukopis. Všichni autoři poskytli kritickou zpětnou vazbu a přispěli ke konečnému rukopisu.,

Prohlášení o střetu zájmů

autoři prohlašují, že výzkum byl proveden bez jakýchkoli obchodních nebo finančních vztahů, které by mohly být chápány jako potenciální střet zájmů.

PubMed Abstraktní | Google Scholar