Gelové Elektroforézy Definice
Gelová elektroforéza je postup použitý k oddělení biologických molekul podle velikosti. Oddělení těchto molekul je dosaženo umístěním do gelu s malými póry a vytvořením elektrického pole přes gel. Molekuly se budou pohybovat rychleji nebo pomaleji na základě jejich velikosti a elektrického náboje.,
Gelové Elektroforézy Přehled
proces gelová elektroforéza funguje, protože negativně nabité molekuly pohybují od negativního pólu elektrického proudu a menší molekuly se pohybovat rychleji než větší molekuly. Tím se dosáhne separace velikosti v bazénu molekul procházejících gelem. Gel pracuje podobným způsobem jako síto oddělující částice podle velikosti. Elektroforéza pracuje na pohybu částic pomocí jejich vlastního elektrického náboje přes síto.,
Když vědci se snaží rozlišovat mezi různými segmenty DNA, například, proces je jednoduchý. Vzorky jsou načteny do kanálů na začátku gelu. Každá molekula DNA má stejný náboj (-1), protože DNA je tvořena stejné 4 nukleotidy a vždy nese mírně negativní náboj bez ohledu na jeho velikost. Proto každá molekula DNA bude mít stejnou sílu, která ji protáhne gelem.
velikost každé molekuly však brání jejímu pokroku prostřednictvím gelu., Velké molekuly zasáhly části gelové matrice a zpomalily se. Malé molekuly DNA mohou proklouznout mezi různými složkami gelové matrice a rychle se dostanou na druhou stranu gelu. Po určité době lze barvené molekuly DNA vidět agregaci v různých oblastech gelu na základě toho, jak daleko se pohybovaly během gelové elektroforézy. To umožňuje vědcům identifikovat segmenty a porovnat DNA různých organismů.
k čemu se používají gelové elektroforézy?,
účelem gelové elektroforézy je vizualizace, identifikace a rozlišení molekul, které byly zpracovány předchozí metodou, jako je PCR, enzymatické trávení nebo experimentální stav. Často, směsi nukleových kyselin nebo proteinů, které jsou shromažďovány z předchozího experimentu/metody jsou spouštěny prostřednictvím gelové elektroforézy pro stanovení totožnosti nebo rozlišovat mezi molekulami.,
Gelové Elektroforézy Kroky
široké kroky ve společné DNA gelová elektroforéza protokolu:
Příprava vzorků pro běh
DNA je izolována a předzpracovány (např. PCR, enzymatické trávení) a tvoří v roztoku s některými základními modré barvivo pomoci vizualizovat pohyb vzorku v gelu.
gelový roztok AGARÓZY TAE je připraven
Tae pufr poskytuje zdroj iontů pro nastavení elektrického pole během elektroforézy., Pro přípravu roztoku se používá koncentrace agarózy v Tae pufru na objem. Například pokud je vyžadován 1% agarózový gel, přidá se 1 g agarózy do 100 ml TAE. Použité procento agarosy je určeno tím, jak velká nebo malá má být DNA. Jestliže jeden se dívá na oddělující bazén menší velikosti DNA kapel (<500bp), vyšší procento agarózového gelu (>1%), je připraven. Vyšší procento agarózy vytváří hustší síto pro zvýšení separace malých rozdílů délky DNA., Roztok agarose-TAE se zahřeje, aby se agaróza rozpustila.
Odlévání gelu
TAE agarózového roztok se nalije do obsazení zásobníku, který, jakmile gel, roztok se ochladí a ztuhne, vytvoří gel desky s řadou vrtů v horní části.
nastavení elektroforézy
pevný gel se umístí do komory naplněné Tae pufrem. Gel je umístěn tak, aby komorové studny byly nejblíže záporné elektrodě Komory.,
načítání gelu
studny gelové komory jsou načteny vzorky DNA a obvykle je jako odkaz na velikosti načten také žebřík DNA.
elektroforéza
záporné a kladné vodiče jsou připojeny k komoře a k napájecímu zdroji, kde je napětí nastaveno. Zapnutí napájení nastaví elektrické pole a záporně nabité DNA vzorky začnou migrovat přes gel a od záporné elektrody ke kladné.,
Zastavení elektroforéza a vizualizace DNA
Jakmile je modré barvivo v vzorky DNA byla přenesena prostřednictvím gel dostatečně daleko, napájení je vypnut a gel se odstraní a umístí se do ethidium bromid řešení. Ethidiumbromid interkaluje mezi DNA a je viditelný v UV světle. Někdy se ethidiumbromid přidává přímo do roztoku agarózového gelu v kroku 2. Ethidiumbromid obarvený gel je pak vystaven UV záření a je pořízen snímek. Dna pásy jsou vizualizovány z každého pruhu, který odpovídá komoře dobře., Dna žebřík, který byl načten, je také vizualizován a lze odhadnout délku dna pásů. Příklad je uveden na obrázku níže.
Druhy Gelu, Elektroforéza
k Dispozici jsou dva typy gelu elektroforéza: nativní a denaturační. Nativní gelová elektroforéza se obvykle pokouší udržet RNA nebo protein ve své původní struktuře, zatímco ji prochází gelem., Denaturační gelová elektroforéza se pokouší redukovat RNA nebo protein do své nejlineárnější struktury před nebo během gelové elektroforézy.
denaturace RNA nebo proteinu se provádí přidáním redukčního činidla do vzorku, gelu a/nebo pufru. Redukční činidlo odděluje vazby v molekule RNA nebo proteinu a tím snižuje jeho sekundární strukturu. Sekundární struktura proteinu nebo RNA bude nelineárním způsobem ovlivňovat, jak rychle migruje přes gel., Denaturovaná lineární forma RNA nebo proteinu však bude migrovat úměrně své lineární velikosti (párů bází nebo kilo daltonů). Denaturační gelová elektroforéza je často přesnější pro identifikaci velikosti, zatímco nativní gelová elektroforéza se obvykle používá k identifikaci větších proteinových komplexů.
příklady gelové elektroforézy
- Tae agarose gel elektroforéza se nejčastěji používá pro DNA.
- TBE a denaturační stránka (elektroforéza polyakrylamidového gelu) jsou běžné pro separaci RNA.,
- SDS PAGE je denaturační gelová elektroforéza běžně používaná pro identifikaci a separaci proteinů.