Co je elektroforéza polyakrylamidového gelu (strana)?

Elektroforetické techniky samostatných nabitých molekul v elektrickém poli. Mobilita molekuly je nepřímo úměrná její velikosti a přímo úměrná jejímu náboji. Během elektroforézy se proteiny pohybují směrem k opačně nabité elektrodě v elektrickém poli.,

rychlost jejich pohybu v elektroforézní systém se řídí několika faktory, jako jsou teplota, pH a koncentrace pufru kromě vnitřní vlastnosti, jako jsou velikost, náboj a tvar bílkoviny.

elektroforetická separace proteinů striktně na základě jejich molekulové hmotnosti je možná pouze v případě, že náboj všech proteinových molekul může být manipulován se stejným znaménkem. V takovém případě bude mobilita proteinových molekul záviset pouze na jejich velikosti.,

Polyakrylamidové gelové elektroforézy (PAGE) je metoda založená na této myšlence a používá se k oddělení proteinů na základě jejich velikosti.

principy PAGE

na stránce se používá aniontový detergent zvaný dodecylsulfát sodný (SDS), který se váže na proteiny a dává jim negativní náboj. Proteiny jsou pak odděleny electrophoretically podle jejich velikosti pomocí gelové matrice z polyakrylamidovém v elektrickém poli.

Polyakrylamidovém je produkován jako výsledek polymerační reakce mezi akrylamidu a N,N‘-methylen-bis-akrylamidu (BIS) za použití katalyzátoru., Stupeň polymerace nebo zesítění může být řízen úpravou koncentrace akrylamidu a BIS.

čím více je zesítění, tím tvrdší je gel. Tvrdost gelu zase moduluje tření, které zažívají makromolekuly, když procházejí gelem během stránky, což ovlivňuje rozlišení oddělení.

Volné gely (4-8% akrylamidu) umožňují vyšší molekulovou hmotnost molekuly migrují rychleji přes gel, zatímco tvrdé gely (12-20% akrylamidu) omezují migraci velkých molekul a selektivně povolit ty malé se pohybovat gelem.,

SDS-PAGE protocol

1. Příprava vzorku:

vzorky bílkovin se denaturují zahříváním saponátem SDS a merkaptoethanolem. Bývalý silně váže na proteiny a dodává jim vysoký negativní náboj, zatímco druhá osvobozuje sulfhydrylové skupiny, čímž polypeptidových řetězců nesoucí přebytek záporného náboje a podobné náboj na hmotnostní poměr. To pomáhá rozlišení proteinů striktně na základě jejich velikosti během gelové elektroforézy.

2., Příprava gelu:

elektroforetický gel má obvykle několik složek včetně akrylamidu, BIS a pufru. Směs se odplyňuje, aby se zabránilo tvorbě bublin během polymerace gelu. Pro zahájení polymerace se přidá persulfát amonný, zdroj volných radikálů a stabilizátor. BIS se také přidává k vytvoření křížových vazeb mezi molekulami akrylamidu, dokud se nakonec nevytvoří gel.

3. Elektroforéza:

jako elektrický proud se aplikuje proteiny migrují přes gel na pozitivní elektrodu, protože mají záporný náboj., Každá molekula se pohybuje jinou rychlostí na základě své molekulové hmotnosti-malé molekuly se pohybují rychleji přes gel než větší. Migrace je obvykle rychlejší při vyšším napětí. Po několika hodinách jsou proteinové molekuly odděleny velikostí.

4. Barvení a vizualizace:

Jednou elektroforéza je kompletní, gel může být obarveny pomocí barevných barvivy jako Coomassie Brilliant Blue nebo ethidium bromid, aby se oddělí proteiny jeví jako zřetelné barevné proužky na gelu.

nevázané barvivo se vymyje z gelu., Obarvené gely se pak suší, takže lze měřit intenzitu barev proteinových pásů. Pásy radioaktivních proteinů mohou být detekovány autoradiografií. Proteiny mohou být také kvantifikovány, protože obsah bílkovin je přímo úměrný množství vázaného barviva.

některé gelové systémy zavádějí sledovací barvivo, jako je bromfenol blue, spolu se vzorkem bílkovin-viditelná vzdálenost ujetá barvivem na gelu pomáhá při rozhodování o požadované délce elektroforézy., Bromfenol modrá cestuje spolu s molekulami vzorku, dokud nakonec nedosáhne dna gelu. Elektroforéza se musí zastavit v tomto bodě, aby se zajistilo, že žádné proteinové molekuly elektroforézy z gelu a do pufru.

Další Čtení

• Všechny Elektroforéza Obsah
• Elektroforéza jako Nástroj pro Forenzní
• Typy Kapilární Elektroforézy

citace