Objev SmacCas9
změnit rodové 5\(v^{\prime}\)-NGG-3\(v^{\prime}\) PAM specifičnost SpyCas9, brzy a nedávné zprávy zaměstnán řízeného vývoje (např. „VQR“, „EQR“, „VRER“, a „NRNH“ varianty) nebo racionální design informován krystalové struktury (např. „QQR“, „NG“, a „NR“ varianty)17,18,19,20,21,22. Tyto zprávy se zaměřily na PAM-kontaktování arginin zbytky R1333 a R1335, že zrušit funkce, pokud výhradně zmutoval., Zatímco tyto studie identifikovány kompenzační mutace vzniklé ve změněné PAM specifičnosti, Cas9 varianty, které jsou vyrobeny udržuje guanin přednost alespoň v jedné pozici PAM sekvence pro nahlášené in vivo úpravy. Souběžné zprávy používají evoluční informace, aby dále uvolnit kanonické 5\(v^{\prime}\)-NNGRRT-3\(v^{\prime}\) PAM specifičnost Staphylococcus aureus Cas9 (SaCas9) nebo objevovat alternativní 5\(v^{\prime}\)-NNNNCC-3\(v^{\prime}\) PAM specifika kanonických 5\(v^{\prime}\)-NNNNGHTT-3\(v^{\prime}\) PAM Neisseria meningitidis Cas923,24., Nukleázy z obou těchto nových zpráv však stále preferují obsah GC v alespoň jedné poloze sekvence PAM. Zaměřily jsme se na zrušení tohoto GC-obsah předpoklady prostřednictvím vlastní bioinformatika-řízený workflow, které doly stávající PAM rozmanitosti v Streptococcus genus25. Pomocí této strategie, jsme se přemístili na SmacCas9 jako mající potenciál nést změnil non-GC PAM specifičnost na vyrovnání 115 orthologs z SpyCas9 z UniProt (omezeno na ty, kteří s větší než 70% po dvou BLOSSOM62 skóre)., Z vyrovnání jsme našli SmacCas9 byl jedním ze dvou blízko homologů, spolu s Streptococcus mutans B112SM-Cas9 (SmutCas9), mající glutamines na obě pozice zarovnán na jinak vysoce konzervovaným PAM-kontaktování arginines (Obr. 1a-b; Doplňkový Obr. 2A). Arginin zbytky jsou známo, že silně preferují guanines v amino-acid-base interakce krajiny, o čemž svědčí 5\(v^{\prime}\)-NGG-3\(v^{\prime}\) specifičnost SpyCas9. Zbytky glutaminu se naopak přednostně váží na adeniny interakcí s hlavním drážkovým okrajem26., Předpokládali jsme tedy, že SmacCas9 přirozeně vyvinul nezbytné kompenzační mutace, aby získal nové uznání PAM bohatého na adenin. Malá velikost vzorku 13 rozpěrek z odpovídajícího genomu CRISPR array nám zabránila v důvěře vyvozovat SMACCAS9 PAM v silico., Nicméně, možnosti pro SmacCas9 vyžaduje méně GC-obsah v jeho PAM byla podpořena sekvenční podobnosti s „QQR“ varianta, která má 5\(v^{\prime}\)-NAAG-3\(v^{\prime}\) specificity27, kromě NA-bohatý domnělý konsensus PAM pro phage-původní podložky CRISPR pole spojené s vysoce homologní SmutCas9, které byly identifikovány s pomocí našich dříve popsané SPAMALOT potrubí a v souladu s předchozí předpovědí (Obr. 1C; Doplňkový Obr. 2b; Doplňkový Obr. 3) 25,28.
Sekvence zarovnání SpyCas9, jeho QQR varianta, a SmacCas9. Krok v podtržené červené čáře označuje spojení SpyCas9 a SmacCas9 pro konstrukci hybridu SpyMac. Logo sekvence (Weblogo online tool) bezprostředně pod zarovnáním zobrazuje zachování na 11 pozicích kolem Pam-kontaktujících argininů SpyCas9., b doména organizace SpyCas9 vedle sebe přes barevně kódované struktury RNA naváděné, cílovou vázanou SpyCas9 (PDB ID 5F9R). Dva řetězce DNA jsou černé s výjimkou purpurového segmentu odpovídajícího PAM. Modré–zelené–červené barevné mapy se používá pro označení Cas9 PI domény a průvodce distanční sekvence pro zvýraznění struktur, které poskytují sekvence specifičnosti a prevalence intra-domain kontakty v rámci PI43. c sekvence logo vytvořené online (WebLogo), který byl vstup s domnělými PAM sekvence nalezené v Streptococcus phage a spojené s téměř SmacCas9 homologů.,
Strojírenství a PAM charakteristika SpyMac
Jsme postupovali empiricky určit PAM preferencí z několika Streptococcus orthologs, že změna jedné nebo obou kritických PAM-kontakty. Na základě prokázané příklady PAM-interakční domény (PID) a guide RNA (gRNA), která má křížové kompatibilitu mezi Cas9 orthologs, které jsou úzce spojené a aktivní, vytvořili jsme nové varianty tím, že racionálně výměnu PI regionu katalyticky „mrtvý“ SpyCas9 (dSpyCas9) s těmi vybrané orthologs (Doplňkový Obr., 2A-B) 29,30. Sestavené varianty, včetně dSpyMacCas9 (dále jen dSpyMac), byly zvlášť cotransformed do E. coli buňky, spolu s guide RNA odvozené od S. pyogenes a 8-mer PAM knihovny jednotné základny zastoupení v PAM-SCANR genetické obvodu, zřízeným Leenay et al.31. Obvod upreguluje zelený fluorescenční protein (GFP) reportér v poměru k síle vazby PAM. Proto jsme shromáždili populace buněk pozitivních na GFP průtokovou cytometrií (Doplňkový Obr., 4) a Sanger sekvenován, je kolem místa PAM určit pozici-moudrý základní preference v odpovídající varianta je PAM uznání. dspymac, více než dSpyMutCas9, vytvořil stopový profil, který byl nejvíce v souladu s uznáním Pam nezávislým na guaninu, spolu s dominantní specificitou pro adenin dinukleotidy(obr. 2a; Doplňkový Obr. 2C).
Chromatogramy představující PAM-SCANR na základě obohacení varianta-rozpoznání PAM sekvence z 5\(v^{\prime}\)-NNNNNNNN-3\(v^{\prime}\) knihovna. b SYBR-barevné agarózovém gelu vykazuje in vitro trávení 10 nM 5\(v^{\prime}\)-NAAN-3\(v^{\prime}\) substráty na 16 minut inkubace se 100 nM čisté ribonucleoprotein enzymu sestavy. Šípy rozlišují páskování štěpených produktů z nečistého substrátu (horní pásmo)., Maticové grafy shrnují výpočty štěpených zlomků, které byly provedeny ve vlastním skriptu pro zpracování gelových obrazů. Vzorky byly provedeny v nezávislých biologických duplikátech (n = 2). c měření časového průběhu cílového štěpení DNA substrátu pro SmacCas9 a SpyMac. d dna substrát štěpení vyneseny jako funkce 0,25:1, 1:1 a 4:1 molární poměry ribonukleoproteinu na cíl pro divoký typ SpyCas9 a hybridní SpyMac. Zdrojová data jsou poskytována jako zdrojový datový soubor.,
Next, jsme čistí nuclease-aktivní enzymy pokračovat v sondování DNA target recognition potenciál a jedinečnost SpyMac. (Doplňkový Obr. 5A)27,32. Jsme jednotlivě inkubovány v ribonucleoprotein komplex enzymů (složený z Cas9 + crRNA + tracrRNA) s double-stranded cílové substráty všech 5\(v^{\prime}\)/3\(^{\prime}\)-sousední základní kombinace na adenin dinucleotidu PAM (5\(v^{\prime}\)-NAAN-3\(v^{\prime}\); Obr. 2b)., Stručný 16-min trávení indikován oběma wild-type SmacCas9 a hybridní SpyMac štěpí přiléhající k 5\(v^{\prime}\)-NAAN-3\(v^{\prime}\) motivy více široce a rovnoměrně, než bylo oznámeno dříve QQR varianta. SpyMac se dále vyznačoval rychlými rychlostmi řezání DNA, které se podobají kinetice rychlého trávení SpyCas9 (obr. 2c-d) 33. Spustili jsme reakce, které používaly různé délky crrna distančního a tracrRNA sekvence, protože ten se mírně liší mezi genomy s.macacae a s. pyogenes (Doplňkový obr. 5B-E)., Ani jeden z těchto dvou parametrů kompenzovat pomalejší štěpení rychlost SmacCas9, ale my si všiml nepatrné zlepšení v činnosti wild-type forma s původními tracrRNA, které comports s rozhraním průvodce-Cas9 interakce jsou většinou mimo PI domény.
editace genomu pomocí iSpyMac
CRISPResso2 indel analýzy následující NGS z amplifikované genomové regiony posoudit na cíl úpravy iSpyMac ve srovnání s SpyMac a SpyCas9, na uvedených 5\(v^{\prime}\)-NAA-3\(v^{\prime}\) a 5\(v^{\prime}\)-NGG-3\(v^{\prime}\) PAM sekvence. Vzorky byly provedeny ve dvou nezávislých replikátech transfekce (n = 2). B účinnost heatmap nesoulad tolerance testu na genomické cíle., Kvantifikované indel frekvence, jak je hodnotí PŘÍLIV algorithm41, jsou vystaveny pro každý označen jeden nebo dvojí nesoulad v sgRNA pořadí je uvedeno Cas9 varianta a uvedla PAM sekvence. Vzorky byly provedeny ve dvou nezávislých replikátech transfekce (n = 2). C CRISPResso2 genomic base editační analýza po NGS genomických amplikonů pro posouzení konverze cytosinů na thyminy iSpyMac-BE3. Vzorky byly provedeny ve dvou nezávislých replikátech transfekce (n = 2). Všechna zdrojová data jsou poskytována jako zdrojový datový soubor.,
dále jsme hodnotili toleranci iSpyMac na neodpovídající sekvence, tím, že zaměstná sgRNAs přechovávání manželskou postelí nebo samostatnými nesouladu na pevnou protospacer v AAVS gen, který disponuje 5\(v^{\prime}\)-GAAG-3\(v^{\prime}\) PAM sekvence. iSpyMac demonstroval editační schopnosti na cílech s jednotlivými nesoulady v rámci Pam-proximálního segmentu sgRNA., Zmírnit to má off-target sklon, jsme zavedli R691A mutace, která byla dříve izolované přes bakteriální výběr pro SpyCas9 k udržení vysoké na cíl aktivity při snižování off-target editing35. Naše high-fidelity varianta, hi-fi-iSpyMac, vystavoval téměř zanedbatelnou aktivitu na neodpovídající sekvence, ve srovnání s původní enzym, s minimální ztrátou na cílovou činnost (Obr. 3b).,
a Konečně, jsme vybrali okna ze čtyř nukleotidů v VEGFA místo v pořadí souvislosti takové, že žádné jiné CRISPR endonukleázy se hlásil používat pro základní úpravy by nebylo možné jejich základní editace s cytidin deaminázy-tavený enzyme36. Proto jsme cotransfected HEK293T buněk s nickase formě iSpyMac odvozen od dříve hlášeny BE3 architektury pro cytosin základny úpravy (iSpyMac-BE3) a sgRNA plasmidu cílení PAM navazujících vybraných nucleotides5., Měřili jsme efektivní úrovně editace bází ve sklizených buňkách, které vykazovaly více než 20% konverzi cytosinu na thymin v těchto pozicích pomocí analýzy NGS (obr. 3c).