A draft genome of Yersinia pestis from victims of the Black Death | Natur

Der Schwarze Tod von 1347-1351, verursacht durch das Bakterium Yersinia pestis2,3, stellt eine der besten historischen Beispiele für eine aufkommende Infektion mit der schnellen Verbreitung und der hohen Sterblichkeit, zu fordern, schätzungsweise 30-50% der europäischen Bevölkerung nur eine fünf-Jahres-Zeit4. Diskrepanzen in epidemiologischen Trends zwischen der mittelalterlichen Krankheit und modernen Y. Pestisinfektionen haben Kontroversen über das ätiologische Mittel der Pandemie entfacht5,6., Obwohl alte DNA-Untersuchungen Y. pestis2,3 in der alten Pandemie stark in Mitleidenschaft gezogen haben, können genetische Veränderungen im Bakterium teilweise für Unterschiede in der Manifestation und Schwere der Krankheit verantwortlich sein. Um die Evolution des Organismus zu verstehen, ist es notwendig, die genetischen Veränderungen zu charakterisieren, die an seiner Umwandlung von einem sylvatischen Erreger zu einem pandemischen menschlichen Infekt auf der Skala des Schwarzen Todes beteiligt sind, und seine Beziehung zu derzeit zirkulierenden Stämmen zu bestimmen., Hier beginnen wir diese Diskussion, indem wir den ersten Entwurf der Genomsequenz des alten Erregers präsentieren.

Y. pestis ist ein kürzlich entwickelter Nachkomme des bodenbewohnenden Bazillus Yersinia pseudotuberculosis7, der im Laufe seiner Entwicklung zwei zusätzliche Plasmide (pMT1 und pPCP1) erhielt, die ihm spezielle Mechanismen zur Infiltration von Säugetierwirten bieten. Um mögliche evolutionäre Veränderungen in einem dieser Plasmide zu untersuchen, Wir berichteten über das Screening von 46 Zähne und 53 Knochen aus der East Smithfield Collection of London, England für die Anwesenheit des Y., pestis-spezifisches pPCP1 (ref. 3). Historische Daten deuten darauf hin, dass die East Smithfield Burial Ground Ende 1348 oder Anfang 1349 speziell für die Bestattung von Opfern des schwarzen Todes eingerichtet wurde8 (Ergänzende Feigen 1 und 2), was die Sammlung für genetische Untersuchungen antiker Y. pestis gut geeignet macht. DNA-Sequenzdaten für fünf Zähne, die durch molekularen Fang des vollständigen Y. pestis-spezifischen pPCP1 erhalten wurden, zeigten ein C-bis T-Schadensmuster, das für authentische endogene alte DNA9 charakteristisch ist, und die Montage der gepoolten Illumina-Lesevorgänge ermöglichte die Rekonstruktion von 98.68% der 9.,6-Kilobase-Plasmid bei mindestens zweifacher Deckung3.

Um die Eignung von Capture-basierten Methoden zur Rekonstruktion des kompletten alten Genoms zu bewerten, wurden mehrere DNA-Extrakte aus Wurzeln und Kronen, die aus vier der fünf Zähne stammten, die die höchste pPCP1-Deckung3 erbrachten, zur Array-basierten Anreicherung (Agilent) und anschließenden Sequenzierung mit hohem Durchsatz auf der Illumina GAII-Plattform10 verwendet. Die Entfernung doppelter Moleküle und die anschließende Filterung führten zu insgesamt 2.366.647 hochwertigen Chromosomenlesungen (ergänzende Tabelle 1a, b) mit einer durchschnittlichen Fragmentlänge von 55.,53 basispaare (Ergänzende Abb. 4), was typisch für alte DNA ist. Abdeckungsschätzungen ergaben durchschnittlich 28,2 Lesevorgänge pro Stelle für das Chromosom und 35,2 und 31,2 für die pCD1-und pMT1-Plasmide (Abb. 1a, c, d und Ergänzende Tabelle 1b, c). Die Abdeckung war für pPCP1 vorhersehbar niedrig (Abb. 1e), weil für dieses Plasmid spezifische Sonden nicht in den Arrays enthalten waren. Abdeckung korreliert mit GC-Gehalt (Ergänzende Abb. 6), ein zuvor beobachteter Trend für Sequenzdaten mit hohem Durchsatz11., Die Abdeckung auf jeder Hälfte des Chromosoms war aufgrund von Unterschieden in der Sequenzierungstiefe zwischen den beiden Arrays ungleichmäßig, mit 36.46 und 22.41 durchschnittlichen Lesevorgängen pro Stelle für Array 1 bzw. Obwohl eine größere Tiefe zu mehr durchschnittlichen Lesevorgängen pro Site beitrug, erhöhte sie die Gesamtabdeckung nicht, da beide Arrays 93.48% der Zielregionen mit einer mindestens einfachen Abdeckung abdeckten (ergänzende Tabelle 1b)., Dies deutet darauf hin, dass unser Capture-Verfahren erfolgreich Template-Moleküle aus allen genomischen Regionen abgerufen hat, auf die über diese Methode zugegriffen werden kann, und dass eine tiefere Sequenzierung keine zusätzlichen Daten für CO92-Template-Regionen ergeben würde, die nicht in unserem Datensatz enthalten sind.

Abbildung 1: Abdeckungsdiagramme für genomische Regionen sequenziert.

Es ist bekannt, dass die Genomarchitektur unter den vorhandenen Y. pestis strains12 stark variiert. Um die Genreihenfolge in unserem alten Genom zu extrapolieren, analysierten wir die Zuordnung zur CO92-Referenz für alle Extrakte, die von einer einzelnen Person stammten, die die höchste Abdeckung ergab (Individuum 8291). Trotz der kurzen Leselänge unserer alten Sequenzen und der sich stark wiederholenden Natur des Y. pestis-Genoms wurden 2,221 Contigs extrahiert, die CO92 übereinstimmten und insgesamt 4,367,867 bp umfassten., Um potenzielle Regionen des alten Genoms zu identifizieren, die sich architektonisch von CO92 unterscheiden, wurden alle Lesevorgänge, die nicht der CO92-Referenz zugeordnet sind, wiederum für die Contig-Konstruktion in Betracht gezogen. Nach einer Filterung für eine Mindestlänge von 500 bp blieben 2.134 Contigs mit 4.013.009 bp, von denen 30.959 aus nicht zugeordneten Lesevorgängen stammten. Die konventionelle BLAST-Suche wurde nach dem CO92-Genom abgefragt, das Übereinstimmungen für 2,105-Contigs identifizierte. Deutet auf eine veränderte Architektur identifiziert wurde in 10 contigs (Ergänzende Tabelle 2). Ein Beispiel für eine solche Strukturvariante ist in Abb., 2, wobei die referenzgeführte Baugruppe, die nicht zugeordnete Lesevorgänge enthält, um den Haltepunkt zu überspannen, ihre Rekonstruktion validiert. Diese spezifische genetische Orientierung findet sich nur in Y. Pseudotuberkulose und Y. pestis Stämme Mictrotus 91001, 2, Pestoides F und B42003004, die Vorfahren aller Y. pestis häufig mit menschlichen Infektionen assoziiert (Zweig 1 und Zweig 2 strains13,14). Darüber hinaus weisen Diskrepanzen in der Anordnung dieser Region in Zweig 1 und Zweig 2 der modernen Y. pestis-Stämme darauf hin, dass Umlagerungen als separate Ereignisse auf verschiedenen Linien auftraten.,

Abbildung 2: Ausrichtung der abgebildeten rekonstruierten Contigs gegen CO92-und Microtus-Genome.

Einzel-Nukleotid-Unterschiede zwischen unseren alten Genoms und die CO92 Referenz überraschend Bestand von nur 97 chromosomalen Positionen, und 2-und 4-Positionen in der pCD1 und pMT1 Plasmide, beziehungsweise (Ergänzende Tabelle 3), was auf eine enge genetische Erhaltung dieses Organismus über die letzten 660 Jahren. 27 dieser Positionen wurden in einer früheren Analyse von Extant Y nicht gemeldet., pestis-Diversität14 (ergänzende Tabellen 3 und 4). Der Vergleich unseres alten Genoms mit seinem Vorfahren Y. Pseudotuberkulose ergab, dass die mittelalterliche Sequenz das angestammte Nukleotid für alle 97 Positionen enthielt, was darauf hindeutet, dass es keine abgeleiteten Positionen besitzt, die in anderen Y. pestis-Stämmen fehlen. Zwei zuvor berichtete Chromosomenunterschiede3 waren in unseren genomischen Sequenzdaten nicht vorhanden, was darauf hindeutet, dass sie wahrscheinlich von desaminierten Zytosinen stammten, die in der aktuellen Untersuchung über die Uracil-DNA-Glykosylase-Behandlung vor dem Array-Capture entfernt worden wären.,

Um unser altes Genom in einen phylogenetischen Kontext zu stellen, charakterisierten wir alle 1.694 zuvor identifizierten phylogenetisch informativen Positionen14 (Ergänzende Tabelle 4) und verglichen diejenigen aus unserem alten Organismus mit aggregierten Basisaufrufdaten für 17 öffentlich verfügbare Y. pestis-Genome und die angestammte Y. Pseudotuberkulose. Getrennt betrachtet fallen Sequenzen von drei der vier Opfer nur zwei Substitutionen von der Wurzel aller vorhandenen menschlichen pathogenen Y. pestis-Stämme (Abb. 3a), und sie zeigen eine engere Beziehung zu Zweig 1 Y., pestis als Zweig 2; Eines der vier Opfer (Individuum 6330) war jedoch mit einem Stamm infiziert, der drei zusätzliche abgeleitete Positionen enthielt, die in allen anderen Genomen des Zweiges 1 zu sehen waren14. Dies deutet entweder auf das Vorhandensein mehrerer Stämme in der Londoner 1348-1350-Pandemie oder auf mikroevolutionäre Veränderungen in einem Stamm hin, von denen bekannt ist, dass sie bei Krankheitsausbrüchen auftreten15. Zusätzliche Unterstützung für Y., die Pestis-Mikroevolution wird durch das Vorhandensein mehrerer Variantenpositionen angezeigt, für die Sequenzdaten eines Individuums zwei verschiedene Nukleotide bei vergleichbaren Frequenzen zeigen (ergänzende Tabelle 5). Position 2896636 ist beispielsweise eine bekannte polymorphe Position in vorhandenen Y. pestis Populationen 14, und diese Position zeigt den festen abgeleiteten Zustand in einem Individuum (6330) und den polymorphen Zustand in einem anderen (Individuum 8291) bei einer mindestens fünffachen Abdeckung (Ergänzende Abb. 7). Dies ist ein bemerkenswertes Beispiel für die Mikroevolution, die während einer historischen Pandemie erfasst wurde., Die verbleibenden Varianzpositionen sind in den 18 vorhandenen Yersinia-Genomen unverändert, daher können sie für den alten Organismus einzigartig sein und sind daher von weiterem Interesse. Zusätzliche Probenahmen antiker Genome helfen bei der Bestimmung der Häufigkeit dieser Mutationen in co-zirkulierenden Y. pestis-Stämmen und klären die Entstehung von Zweig-2-Stämmen, die in alten Proben noch nicht gemeldet sind.

Bild 3: Phylogenetische Platzierung und den historischen Zusammenhang der East Smithfield-Sorte.,

Konsistente Baumtopologien wurden mit verschiedenen Konstruktionsmethoden erstellt und alle wichtigen Knoten wurden durch posterior probability (pp) – Werte von >0.96 und Bootstrap-Werte unterstützt >90 (Abb. 3b und ergänzende Abbildungen 8 und 9). Die Bäume platzieren die East Smithfield-Sequenz in der Nähe des Ahnenknotens aller vorhandenen menschlichen pathogenen Y. pestis-Stämme (nur zwei Unterschiede in 1.694 Positionen) und an der Basis von Zweig 1 (Abb. 3b)., Ein sicheres Datum für die East Smithfield-Stätte von 1348-1350 ermöglichte es uns, der alten Sequenz eine Spitzenkalibrierung zuzuweisen und so die Divergenzzeit der modernen Genome und des East Smithfield-Genoms mit einem bayesischen Ansatz zu datieren. Zeitliche Schätzungen zeigen, dass alle Y., pestis, die häufig mit einer Infektion beim Menschen in Verbindung gebracht werden, hatten vor 668 bis 729 Jahren einen gemeinsamen Vorfahren (ad 1282-1343, 95% höchste Wahrscheinlichkeitsdichte, HPD), der ein viel kleineres Zeitintervall umfasste als kürzlich veröffentlichte Schätzungen14 und weiter darauf hinweist, dass alle derzeit zirkulierenden Isolate von Zweig 1 und Zweig 2 frühestens im dreizehnten Jahrhundert entstanden sind (Abb. 3b), die möglicherweise aus einer ostasiatischen Quelle stammen, wie zuvor vorgeschlagen wurde14., Dies impliziert, dass die mittelalterliche Pest das wichtigste historische Ereignis war, das die menschliche Bevölkerung in den Vorfahren aller bekannten pathogenen Stämme von Y. pestis einführte. Dies stellt die Ätiologie der Justinian-Pest des sechsten bis achten Jahrhunderts in Frage, Im Volksmund angenommen, dass sie aus demselben Erreger resultiert hat: Unsere zeitlichen Schätzungen implizieren, dass die Pandemie entweder durch eine Y. pestis-Variante verursacht wurde, die sich von allen derzeit zirkulierenden Stämmen unterscheidet, die häufig mit menschlichen Infektionen assoziiert sind, oder es war eine andere Krankheit insgesamt.

Obwohl unser Ansatz, ein vorhandenes Y zu verwenden., pestis Referenzvorlage für Köder Design ausgeschlossen unsere Fähigkeit, genomische Regionen zu identifizieren, die im alten Organismus vorhanden gewesen sein können und wurden anschließend in CO92 verloren, genomische Vergleiche unserer alten Sequenz gegen seine engsten Gruppen können wertvolle Einblicke in Y. pestis Evolution ergeben. Der Microtus 91001 Stamm ist der nächstgelegene Zweig 1 und Zweig 2 relativ bestätigt, nicht pathogen für den Menschen zu sein16, daher genetische Veränderungen können Beiträge zur Anpassung des Erregers an einen menschlichen Wirt darstellen., Vergleiche mit dieser Outgroup zeigten signifikante Veränderungen (Ergänzende Tabelle 6a, b), von denen viele in Genen gefunden werden, die virulenzassoziierte Funktionen wie Biofilmbildung (hmsT), Eisenakquisition (iucD) oder Anpassung an die intrazelluläre Umgebung (phoP) beeinflussen. Obwohl sein Virulenzpotential beim Menschen nach unserem Wissen noch nicht bestätigt ist, wurde Y. pestis B42003004, isoliert von einer chinesischen Murmeltierpopulation17, als der Stamm identifiziert, der dem Ahnenknoten aller Y am nächsten ist., pestis häufig mit menschlichen Pest assoziiert, und kann somit wichtige Informationen über die Entwicklung des Organismus liefern. Der vollständige Genomvergleich mit der East Smithfield-Sequenz ergab nur acht Einzelnukleotidunterschiede (ergänzende Tabelle 6c), von denen sechs zu nicht synonymen Veränderungen führen (ergänzende Tabelle 6d). Obwohl diese Unterschiede wahrscheinlich die Virulenz nicht beeinflussen, ist der Einfluss von Genverlust, Genzunahme oder genetischen Umlagerungen,die alle in Y. pestis12, 18 gut dokumentiert sind, noch unbestimmt., In neueren evolutionären Begriffen wurden Einzelnukleotidunterschiede in mehreren bekannten pathogenitätsassoziierten Genen zwischen unserem alten Genom und der CO92-Referenzsequenz gefunden (Ergänzende Tabelle 3), die weitere Anpassungen an menschliche Wirte darstellen können.,

Durch die Anreicherung durch DNA-Capture in Verbindung mit gezielter DNA-Sequenzierung mit hohem Durchsatz haben wir einen Genomentwurf für den wohl verheerendsten menschlichen Erreger in der Geschichte rekonstruiert und gezeigt, dass die mittelalterliche Pest des vierzehnten Jahrhunderts wahrscheinlich für ihre Einführung und Verbreitung in der menschlichen Bevölkerung verantwortlich war. Dies deutet darauf hin, dass der Erreger, der an dem Schwarzen Tod beteiligt ist, im einundzwanzigsten Jahrhundert nahe Verwandte hat, die sowohl endemisch als auch auftauchen19., Die Einführung neuer Krankheitserreger in Populationen ist häufig mit einer erhöhten Inzidenz und Schwere von Krankheiten20 verbunden, und obwohl die Mechanismen, die dieses Phänomen regeln, komplex sind21, genetische Daten von alten Infektionskrankheiten werden unschätzbare Beiträge zu unserem Verständnis der Wirts–Pathogen-Koevolution liefern. Der schwarze Tod ist ein bahnbrechendes Beispiel für eine aufkommende Infektion, die quer durch Europa reist und das Leben von schätzungsweise 30 Millionen Menschen in nur 5 Jahren beansprucht, was viel schneller ist als die heutigen Raten der Beulenpestinfektion oder Lungenpest22 und Verbreitung 7,8., Obwohl kein vorhandener Y. pestis-Stamm das gleiche genetische Profil wie unser alter Organismus besitzt, legen unsere Daten nahe, dass sich in den 660 Jahren der Evolution des Organismus als menschlicher Erreger nur wenige Veränderungen in bekannten virulenzassoziierten Genen angesammelt haben, was darauf hindeutet, dass seine wahrgenommene erhöhte Virulenz in der Geschichte ist23 möglicherweise nicht auf neuartige Fixpunktmutationen zurückzuführen, die über den hier beschriebenen analytischen Ansatz nachweisbar sind., In unserer aktuellen Entschließung stellen wir fest, dass molekulare Veränderungen in Krankheitserregern nur ein Bestandteil einer Konstellation von Faktoren sind, die zur Veränderung der Prävalenz und Schwere von Infektionskrankheiten beitragen, wobei die Genetik der Wirtspopulation24, Klima25, Vektordynamik26, soziale Bedingungen27 und synergistische Interaktionen mit gleichzeitigen Krankheiten28 in erster Linie in Diskussionen über die Anfälligkeit der Bevölkerung für Infektionskrankheiten und die Wirt–Pathogen-Beziehungen in Bezug auf Y. Pestisinfektionen berücksichtigt werden sollten.

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